Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso parte 3

Copertura della mappa fisica

Per il cromosoma 1 di riso, 346 cloni BAC o PAC sono stati sequenziali e mappati da RGP e depositati in GenBank. La posizione di mappa ottenuta dall’analisi in silico ha trovato corrispondenza con i dati ottenuti. Da questa analisi 41 dei 305 cloni utilizzati sono avanzati. Altri controlli sono stati fatti anche su altri cromosomi, ad esempio il numero 10, e a dimostrazione del corretto mappaggio è stato effettuata la tecnica di FISH.

 

Figura 2: Risultato della tecnica FISH

Una stima locale della copertura del genoma di riso è stata fatta esaminando la sequenza del cromosoma 1 di riso. La sua lunghezza è di 43 Mb e presenta 12 gap di cui una parte non dovuti ad errori di mappaggio, fanno ipotizzare una copertura al 99.3% dell’eurocromatina del genoma di riso. Sulla base del numero di bande derivate dai contigs FPC, che coprono 43Mb della sequenza del cromosoma 1, è stato determinato che la media delle bande ottenuta con la restrizione in HindIII  è di 4878bp. Basandoci sulla lunghezza di ogni contigs, che è il numero approssimativo di frammenti non ridondanti, è stato calcolato che i contigs rapprendano 362.9Mb del genoma di riso. Le dimensioni dei gap sono state calcolate sul calcolo della distanza fisica locale rapportata alla distanza genetica.

FISH(Fluorescence In Situ Hybridization) La FISH è una tecnica usata per la costruzione di mappe fisiche: indica la posizione sui cromosomi di determinate sequenze, in questo caso le sequenze centromeriche e telomeriche. Per visualizzare la posizione della sequenza si utilizzano sonde marcate con fluorescenza e poi si osserva il risultato al microscopio. Le cellule vengono messe su vetrini in condizioni denaturanti (ad esempio con la formammide) perché serve DNA a singolo filamento per permettere l’ibridazione con la sonda. Viene quindi aggiunta la probe fluorescente e se ne visualizza la localizzazione con il microscopio. Si utilizzano cromosomi in metafase: la cromatina è molto condensata, i cromosomi sono ben distinguibili e si individua meglio la posizione della sonda.

 

Questa tecnica, però, non è molto precisa. Per avere una maggiore risoluzione è possibile utilizzare cromosomi allungati meccanicamente tramite centrifugazione(distinguere marcatori che distano 200-300 kb). E’ anche possibile utilizzare cromosomi in interfase che quindi non sono superavvolti: si ha una risoluzione fino a 25 kb, ma si perde la morfologia dei cromosomi e non è quindi possibile distinguerli uno dall’altro. Questa tecnica è utile per vedere la distanza relativa di due marcatori che si sa già essere posizionati sullo stesso cromosoma. Utilizzando fluorescenze diverse è possibile osservare l’ibridazione di più sonde contemporaneamente. Come ultima osservazione la FISH può subire interferenze causate dalle sequenze ripetute presenti nel genoma. Per evitare problemi è quindi necessario mascherare queste sequenze aggiungendo DNA non marcato proveniente dallo stesso organismo in esame per minimizzare le ibridazioni aspecifiche. Vedi figura 2

Informazioni ottenute dal osservazione di mappa generica e fisica di riso

La mappa fisica ottenuta può essere considerata molto dettagliata. Infatti, si è partiti da una libreria di 65.000 cloni BAC rappresentativi per venti volte il genoma di riso, poi sottoposti a fingerprinting ed ancoraggio.

Circa il 90% del genoma di riso è stato ancorato geneticamente. Dei cloni ancorati circa l’80% presenta due marcatori quindi orientati correttamente. Più dell’80% del genoma è stato ancorato con più metodi come: marker hybridization, in silico hybridization, FISH e sequenziamento dei cloni.

Il confronto fra mappa fisica e genetica ha permesso di individuare la rapporto fra distanza fisica e distanza genetica dell’intero genoma di riso. La riduzione significativa della frequenza di ricombinazione osservata nelle regioni centromeriche suggerisce che questi siti siano caratterizzati da una ricombinazione genica soppressa. Questo fenomeno è stato osservato anche sui bracci corti dei cromosomi 1, 4 e 10 (vedi figura 3) e probabilmente è giustificato dalla presenza di una porzione di eterocromatina che limita il sequenziamento.

 

 

Metodi
 

I vettori BAC utilizzati sono del tipo pBeloBAC11 e pBACIndgo, e sono stati usati rispettivamente per costruire le librerie di restrizione HindIII e EcoRI. Il DNA vegetale è stato ottenuto da piante di riso di 4-5 settimane cresciute in serra. Successivamente sono state selezionate quelle col minor numero di metaboliti secondari ed il loro DNA è stato sottoposto a restrizione con HindIII e EcoRI.

La ligazione è avvenuta col metodo descritto da Peterson e le colonie ricombinanti sono state selezionate con Genetix Q-bot e sistemate in un microtiter da 384 pozzetti. Il fingerprinting è stato eseguito grazie al software IMAGE che ha analizzato la distanza di ogni frammento di restrizione. Mediamente per ogni clone sono stati trovati 28 frammenti. La libreria di contigs ottenuta rappresenta circa le 453Mb del genoma di riso.
 

Le ibridazioni sono state eseguite usando dei filtri ad alta densità contenenti i cloni delle biblioteche di fingerprinting. Per individuare i marcatori genetici sulle contigs, i cloni di cDNA sono stati digeriti con endonucleasi di restrizione per

trovare l’inserto, che è stato successivamente separato mediante elettroforesi su gel ed isolato con il kit Qiaex. Le sonde sono state poi marcate radio attivamente usando il kit Ambion. Nel caso in cui un frammento RFLP non era disponibile ma era nota la sua sequenza, sono stati progettati dei primer.

 

Per l'articolo originale: Chen M, et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome. Plant Cell. 2002;14(3):537–545.