Il falso mito di Braccio di Ferro

Il corpo umano contiene circa 5 gr di ferro. La maggior parte si trova nell'emoglobina, indispensabile per il trasporto dell'ossigeno nei tessuti. Inoltre è costituente di molti metallo-enzimi tra cui la catalasi e i citocromi.

 

Il ferro si trova nei cibi sotto forma di ferro eme o di ferro non eme. Il ferro non eme si trova sotto forma di ione ferroso (Fe²⁺) o ione ferrico (Fe³⁺), i quali sono solubili rispettivamente a pH 7 e a pH minore di 3.

Il ferro eme si trova solo negli alimenti di origine animale, in particolare nella carne, al contrario dei latticini che non ne contengono.
Il ferro non eme si trova sia nella carne, sia negli alimenti di origine vegetale.

Il ferro eme è quello più facilmente assimilabile dal nostro organismo.

 

Alimenti ricchi di ferroGli spinaci contengono una buona quantità di ferro (2.9 mg) ma contengono anche fitati e l'acido ossalico che limitano l'assorbimento del ferro.

Anche il the e il caffè con i tannini riducono l'assorbimento del ferro.

Mentre la vitamina C e l'acido citrico aumentano la biodisponibilità del ferro, per ciò consumare la carne con una spruzzata di limone facilita l'assorbimento del prezioso minerale.

 

Gioca per Curare il Cancro

Play to Cure™: Genes in Space è un gioco gratuito per cellulari che utilizza dei giocatori per analizzare dati genetici reali e contribuire a combattere il cancro.

I tumori sono spesso correlati con mutazioni genetiche che possono andare da il cambiamento di un singolo nucleotide fino a modificazioni cromosomiche. Un modo per trovare le cause di questo fenomeno è comparare un gran numero di campioni per vedere quali cambiamenti sono associati allo sviluppo della malattia.
L'utilizzo di microarray permette l'analisi di molte migliaia di campioni contemporaneamente, ma questo comporta un'ulteriore sfida, l'analisi di questa enorme quantità di dati.
Un marcatore comune a molti tipi di cancro è la duplicazione/delezione di parti di cromosomi, in particolare per quanto riguarda il cancro al seno.

Il Professor Carlos Caldas ed i suoi colleghi del Cancer Research UK Cambridge Institute hanno provato ad utilizzare un software per identificare queste mutazioni. Graficamente ottenevano una banda che corrisponde alla lunghezza di un cromosoma con alcuni picchi che indicano la presenza di copie extra di una particolare regione. Queste alterazioni possono essere identificate facilmente dall'occhio umano, ma difficilmente da un software.

Da qui nasce l'idea di un videogioco in cui i giocatori aiutano gli scienziati ad individuare le mutazioni e fornire nuovi target per farmaci.

Il gioco consiste nel pilotare un astronave per recuperare l'Elemento Alpha. Tracciando la rotta si aiutano gli scienziati ad analizzare i dati di microarray.

Sotto un video che spiega come funziona il videogioco:



Per maggiori informazioni potete visitare il sito della Cancer Reseach UK

La Prima Cellula di Plastica

Nel corso degli ultimi cinque anni il campo della bioingegneria sintetica ha fatto passi da gigante. Solo pochi anni fa, i ricercatori hanno creato la prima cellula procariotica sintetica.
Ora per la prima volta  i ricercatori olandesi del Radboud University Nijmegen sono riusciti a creare, utilizzando dei polimeri sintetici, una cellula eucariotica artificiale in grado di condurre reazioni chimiche attraverso gli organelli.Le cellule eucariotiche sono i mattoni che formano gli organismi complessi come ad esempio le piante e gli animali. La principale differenza tra procarioti ed eucarioti è la presenza degli organelli in quest'ultime. Gli organelli sono delle subunità che possono compiere diverse funzioni indispensabili per la vita.

I ricercatori hanno utilizzato una goccia, di una soluzione simile al citoplasma, come base per la costruzione della cellula. Gli organelli sono stati  creati iniettando alcuni enzimi, che potessero catalizzare certe reazioni, in sfere di polistirolo. Questi nanoreattori sono stati inseriti all'interno della goccia che è stata rivestita con una parete in plastica.

 

In questo modo si è formata una struttura a compartimenti simile ad una cellula eucariotica.

Utilizzando la fluorescenza hanno potuto monitorare le reazioni chimiche che avvenivano all'interno della cellula, la prova di essere riusciti a creare una cellula con degli organelli funzionanti.

Il loro lavoro è stato pubblicato sulle riviste Angewandte Chemie ed Nature Chemistry.

Batteri e cancro.

Helicobacter pylori è un batterio che colonizza la mucosa intestinale nella metà della popolazione umana, in alcuni casi può causare un'infiammazione gastrica. I ricercatori dell'Università di Nariño in Colombia hanno dimostrato che la presenza di alcuni ceppi di H. pylori sono correlati con l'insorgenza del cancro allo stomaco.
Sono state prese in esame due popolazione che vivevano nei dintorni di Tumaco in Colombia.
La popolazione della città costiera era in prevalenza di origine africana, mentre la comunità che vive in montagna è in maggioranza indigena.
La comunità montana ha mostrato un tasso di cancro allo stomaco causata dal batterio Helicobacter pylori 25 volte superiore rispetto alla comunità costiera.

Sono stati prelevati dei campioni da entrambe le popolazioni, i ricercatori hanno scoperto che nei pazienti della regione costiera, con una bassa incidenza di cancro allo stomaco, hanno visto prevalere un ceppo batterico di origine africana. In quelli della regione di montagna, in cui il cancro allo stomaco è più comune, si è trovato un ceppo di H. pylori proveniente dall'Europa meridionale.

Questi risultati suggeriscono che esiste una storia evolutiva comune tra gli esseri umani e i batteri che comportata un rapporto ospite-patogeno meno virulento.

Inoltre è stato visto che gli amerindi che possedevano il ceppo africano di Helicobacter avevano più probabilità di avere gravi lesioni gastriche.
Ovviamente questo non è da considerare l'unico fattore che influenza l'insorgenza di certe patologie, ma ci da un idea delle molteplici cause che bisogna considerare.

Electron micrograph of H. pylori WIKIMEDIA,

N. Kodaman et al., “Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease,” PNAS, doi/10.1073/pnas.1318093111, 2014.

Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso parte 3

Copertura della mappa fisica

Per il cromosoma 1 di riso, 346 cloni BAC o PAC sono stati sequenziali e mappati da RGP e depositati in GenBank. La posizione di mappa ottenuta dall’analisi in silico ha trovato corrispondenza con i dati ottenuti. Da questa analisi 41 dei 305 cloni utilizzati sono avanzati. Altri controlli sono stati fatti anche su altri cromosomi, ad esempio il numero 10, e a dimostrazione del corretto mappaggio è stato effettuata la tecnica di FISH.

 

Figura 2: Risultato della tecnica FISH

Una stima locale della copertura del genoma di riso è stata fatta esaminando la sequenza del cromosoma 1 di riso. La sua lunghezza è di 43 Mb e presenta 12 gap di cui una parte non dovuti ad errori di mappaggio, fanno ipotizzare una copertura al 99.3% dell’eurocromatina del genoma di riso. Sulla base del numero di bande derivate dai contigs FPC, che coprono 43Mb della sequenza del cromosoma 1, è stato determinato che la media delle bande ottenuta con la restrizione in HindIII  è di 4878bp. Basandoci sulla lunghezza di ogni contigs, che è il numero approssimativo di frammenti non ridondanti, è stato calcolato che i contigs rapprendano 362.9Mb del genoma di riso. Le dimensioni dei gap sono state calcolate sul calcolo della distanza fisica locale rapportata alla distanza genetica.

FISH(Fluorescence In Situ Hybridization) La FISH è una tecnica usata per la costruzione di mappe fisiche: indica la posizione sui cromosomi di determinate sequenze, in questo caso le sequenze centromeriche e telomeriche. Per visualizzare la posizione della sequenza si utilizzano sonde marcate con fluorescenza e poi si osserva il risultato al microscopio. Le cellule vengono messe su vetrini in condizioni denaturanti (ad esempio con la formammide) perché serve DNA a singolo filamento per permettere l’ibridazione con la sonda. Viene quindi aggiunta la probe fluorescente e se ne visualizza la localizzazione con il microscopio. Si utilizzano cromosomi in metafase: la cromatina è molto condensata, i cromosomi sono ben distinguibili e si individua meglio la posizione della sonda.

 

Questa tecnica, però, non è molto precisa. Per avere una maggiore risoluzione è possibile utilizzare cromosomi allungati meccanicamente tramite centrifugazione(distinguere marcatori che distano 200-300 kb). E’ anche possibile utilizzare cromosomi in interfase che quindi non sono superavvolti: si ha una risoluzione fino a 25 kb, ma si perde la morfologia dei cromosomi e non è quindi possibile distinguerli uno dall’altro. Questa tecnica è utile per vedere la distanza relativa di due marcatori che si sa già essere posizionati sullo stesso cromosoma. Utilizzando fluorescenze diverse è possibile osservare l’ibridazione di più sonde contemporaneamente. Come ultima osservazione la FISH può subire interferenze causate dalle sequenze ripetute presenti nel genoma. Per evitare problemi è quindi necessario mascherare queste sequenze aggiungendo DNA non marcato proveniente dallo stesso organismo in esame per minimizzare le ibridazioni aspecifiche. Vedi figura 2

Informazioni ottenute dal osservazione di mappa generica e fisica di riso

La mappa fisica ottenuta può essere considerata molto dettagliata. Infatti, si è partiti da una libreria di 65.000 cloni BAC rappresentativi per venti volte il genoma di riso, poi sottoposti a fingerprinting ed ancoraggio.

Circa il 90% del genoma di riso è stato ancorato geneticamente. Dei cloni ancorati circa l’80% presenta due marcatori quindi orientati correttamente. Più dell’80% del genoma è stato ancorato con più metodi come: marker hybridization, in silico hybridization, FISH e sequenziamento dei cloni.

Il confronto fra mappa fisica e genetica ha permesso di individuare la rapporto fra distanza fisica e distanza genetica dell’intero genoma di riso. La riduzione significativa della frequenza di ricombinazione osservata nelle regioni centromeriche suggerisce che questi siti siano caratterizzati da una ricombinazione genica soppressa. Questo fenomeno è stato osservato anche sui bracci corti dei cromosomi 1, 4 e 10 (vedi figura 3) e probabilmente è giustificato dalla presenza di una porzione di eterocromatina che limita il sequenziamento.

 

 

Metodi
 

I vettori BAC utilizzati sono del tipo pBeloBAC11 e pBACIndgo, e sono stati usati rispettivamente per costruire le librerie di restrizione HindIII e EcoRI. Il DNA vegetale è stato ottenuto da piante di riso di 4-5 settimane cresciute in serra. Successivamente sono state selezionate quelle col minor numero di metaboliti secondari ed il loro DNA è stato sottoposto a restrizione con HindIII e EcoRI.

La ligazione è avvenuta col metodo descritto da Peterson e le colonie ricombinanti sono state selezionate con Genetix Q-bot e sistemate in un microtiter da 384 pozzetti. Il fingerprinting è stato eseguito grazie al software IMAGE che ha analizzato la distanza di ogni frammento di restrizione. Mediamente per ogni clone sono stati trovati 28 frammenti. La libreria di contigs ottenuta rappresenta circa le 453Mb del genoma di riso.
 

Le ibridazioni sono state eseguite usando dei filtri ad alta densità contenenti i cloni delle biblioteche di fingerprinting. Per individuare i marcatori genetici sulle contigs, i cloni di cDNA sono stati digeriti con endonucleasi di restrizione per

trovare l’inserto, che è stato successivamente separato mediante elettroforesi su gel ed isolato con il kit Qiaex. Le sonde sono state poi marcate radio attivamente usando il kit Ambion. Nel caso in cui un frammento RFLP non era disponibile ma era nota la sua sequenza, sono stati progettati dei primer.

 

Per l'articolo originale: Chen M, et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome. Plant Cell. 2002;14(3):537–545.
 

Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso parte 2

Costruzione della libreria di BAC, fingerprinting e montaggio dei contigs

Inizialmente sono state costruite due librerie di cloni BAC analizzando su agarosio il DNA ad alto peso molecolare del genoma di riso. Per fare ciò il DNA fu parzialmente digerito nei siti di restrizione HindIII ed EcoRI  e successivamente rilegati. La trasformazione è stata effettuata su E. Coli piastrato su terreno selettivo. La libreria fatta con HindIII consiste in 36,864 cloni ognuno dei quali contenente in media 129kb, mentre quella effettuata con EcoRI consiste in 55,296 cloni con una media di 121kb ciascuno. È stato calcolato che circa il 5% dei cloni di ogni libreria erano contaminati o non contenevano l’inserto, quindi sono stati in seguito eliminati.


 I 65,287 cloni BAC sono stati sottoposti a fingerprinting.


Il fingerprinting è una tecnica che serve per determinare l’impronta digitale di un clone (in questo caso). Tale tecnica si effettua digerendo il DNA dei cloni in determinati  Siti di restrizione specifici, come HindIII e EcoRI, e successivamente fatto correre su gel. Dopo la corsa saranno visibili le bande dei frammenti generati di ogni contigs. Confrontando il bandeggio dei vari contigs è possibile determinare quali di essi possiedono lo stesso frammento, sono chimerici o non contengono l’inserto d’interesse. Tali analisi viene ottimizzata attraverso un approccio in silico, reso possibile grazie all’utilizzo di appositi programmi come il software IMAGE. I cloni individuati attraverso l’analisi del fingerprinting vengono poi scartati.

Il DNA è stato digerito completamente con HindIII e fatto correre su gel di agarosio ad alta risoluzione. Successivamente ogni clone è stato sottoposto a fingerprinting grazie al software IMAGE che ha analizzato la distanza di ogni frammento di restrizione. Mediamente per ogni clone sono stati trovati 28 frammenti di fingerprinting. Grazie al questa tecnica è stato possibile eliminare i cloni chimerici o ridondanti. La libreria di contigs ottenuta rappresenta circa le 453Mb del genoma di riso. Tale sovrastima è dovuta al fatto che i cloni che compongono il contigs contengono sequenze sovrapponibili fra loro. L’analisi di tutti gli scaffolds ancorati alla mappa genetica ha permesso di risalire a quella fisica. In seguito a questo passaggio è stato fatta una correzione manuale, in modo da eliminare eventuali gap o errori nella mappatura.

Il montaggio dei contigs migliora la mappa fisica in due modi. Primo, identifica i punti di continuità fra i contigs riducendo quindi il numero dei gap. Secondo, identifica i potenziali contigs chimerici individuando false sovrapposizioni o individuando dati in conflitto.

Ancoraggio dei cloni BAC alla mappa genetica

Sono stati utilizzati quattro passaggi per correlare la mappa genetica a quella fisica del genoma di riso. Per primo sono state progettate delle probe partendo dai marcatori genetici utilizzati nel Japanese Rice Genome Program per la mappa genetica. Ogni probe di DNA per l’ibridazione su gel è stata costruita a partire da marker localizzati a intervalli di 3-5 cM su ognuno dei 12 cromosomi di riso, in modo da coprire tutto il genoma (vedi tabella 1). In questo modo è stato possibile assegnare la corretta collocazione del clone sul genoma confrontando i marcatori presenti nei cloni e sulla mappa genetica.

Tabella 1: la tabella mostra i primer, i marker e i contigs usati per il mappaggio di ogni cromosoma.

 

I sequence tagged connectors (STCs) sono le estremità sovrapponibili dei diversi conting. Cercando gli STCs è possibile determinare l’ordine dei contigs anche senza conoscerne l’intera sequenza. La RFLP viene utilizzata per quella classe di marcatori basata su tecniche di ibridazione. Infatti, l’RFLP deve la sua origine alla scoperta degli enzimi di restrizione e all’invenzione della Southern Blot. Questa tecnica è basata sulla disponibilità di sequenze di DNA note, che possono essere utilizzate per individuare sequenze omologhe presenti su genomi in corso di studio e che manifestano una variazione a livello del DNA. Tale variazione è definita polimorfismo, che in questo caso è dovuta ad una variazione della lunghezza dei frammenti di DNA digeriti con gli enzimi di restrizione.

 In secondo luogo è stata fatta un ibridazione in silico. Sono state sequenziale entrambi le estremità di ogni clone BAC delle librerie HindIII e EcoRI, generando 110.438 STCs. Tutte le STCs sono state usate nel tentativo di ancorare i contigs basandosi sulle sequenze di omologia attraverso la RFLP. Dal confronto della mappa ottenuta in silico e quella in vivo è stato possibile verificare se il mappaggio era avvenuto in maniera corretta.

 Terzo, per verificare se i contigs ancorati agli estremi del cromosomi fossero esattamente nella posizione corretta, sono state sequenziate le rispettive estremità destra e sinistra. Da quest’ultime sono stati generati dei primer per amplificare le regioni estreme dei cromosomi. L’amplicone ottenuto è stato utilizzato come sonda nelle librerie  HindIII e EcoRI dei cloni BAC per selezionare gli individui che effettivamente contengono le sequenze fiancheggianti dei cromosomi. Per verificare che i cloni ibridati fossero gli stessi dai quali sono stati generati i primer, sono stati confrontanti i fingerprinting.

Quarto, partendo dai dati ottenuti da una precedente bozza di sequenziamento fatta da Monsanto, sono stati associate in silicio le sequenze dei BAC Monsanto e quelle dei cloni CUGI in modo da ottimizzare la mappa fisica eliminando eventuali errori e chiudendo i gap.

 

Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso Parte 1

Introduzione

 

Il riso è il più importante cibo per l’alimentazione umana, infatti, per oltre due miliardi e mezzo di uomini questo cereale è l'elemento principale dell'alimentazione e in alcuni paesi asiatici arriva a fornire addirittura i tre quarti dell' apporto calorico. Il riso è molto studiato come organismo modello per il sequenziamento genomico poiché è economico, ha un piccolo genoma (430 Mb divise in 37.000 geni), presenta moltissime interconnessioni evolutive con genomi di altre specie vegetali e perché sono disponibili notevoli informazioni sul suo genoma come mappe fisica, collezione di ESTs e librerie di lievito (YAC).

 

Le Expressed Sequence Tags (ESTs) sono dei brevi frammenti di DNA trascritti e sequenziati a partire dal cDNA, rappresentano parti di geni espressi e possono essere utilizzate come sonde per identificare quali proteine vengono espresse in una cellula.    

 

 

L’International Rice Genome Sequencing Project (RGP) ha portato a termine la determinazione ed il sequenziamento dell’intero genoma di riso nel 2005 usando la tecnica clone-by-clone. Questa tecnica era stata precedentemente provata con efficacia per il sequenziamento del genoma di uomo, Caenorhabditis elegans e Arabidopsis. Il mappaggio fisico del genoma di riso è fondamentale per il successivo sequenziamento, inoltre, completato anche quest’ultimo è possibile determinare i geni importanti dal punto di vista biologico ed agricolo.

 

In passato fu ottenuta una mappa fisica utilizzando  YAC che ha permesso di coprire il 63% del genoma di riso. Tuttavia, l’alta frequenza di chimere, la difficile manipolazione e purificazione hanno reso YAC un vettore non ideale per questo mappaggio. Per tale motivo è stato preferito BAC. Questo clone può contenere larghi inserti ed ha un basso numero di copie di cloni. È stata quindi fatta una libreria BAC della variante di riso Japonica che è stata sottoposta a fingerprinting sfruttando i siti di restrizione HindIII ed utilizzata per determinare la mappa fisica.

I vettori chimerici sono sequenze che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo può essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso.

 

La mappa fisica di riso è stata organizzata in 65,287 cloni di BAC sovrapposti, di cui 62,509 sono stati organizzati in 458 contigs, di cui 284 contengono circa 362.9 Mb e sono stati messi in correlazione con la mappa genetica, determinando quindi che il 90.6% del genoma di riso è rappresentato da tali cloni.

 

Contigs Per l’ottenimento di una mappa fisica è necessario partire da una mappa genetica ottenuta analizzando la disposizione dei marcatori all’interno della progenie. Successivamente si procede con la digestione del DNA e la creazione di una libreria BAC (in questo caso). Questi cloni vengono poi sottoposti a fingerprinting per eliminare quelli ridondanti o chimerici. Infine, analizzando la posizione dei marcatori utilizzati per la strutturazione della mappa genetica è possibile trovare una corrispondenza fra il frammento di DNA contenuto nel clone e la sua effettiva collocazione all’interno del genoma. I cloni ancorati sono detti contigs e nel loro complesso formano degli scaffolds.