Come si può inserire il pathway per la produzione della vitamina A nel riso?
Innanzitutto si sono effettuati degli studi per vedere quale intermedio era presente nel riso. Si è scoperto che l'endosperma conteneva il primo intermedio del pathway, il geranylgeranyl difosfato (GGPP).
Per arrivare alla formazione del β-carotene si possono seguire due strade differenti, la prima via è quella utilizzata dalle piante e prevede l'utilizzo di due enzimi: il Phytoene Desaturasi, il β-Carotene Desaturasi. Alternativamente la trasformazione può essere semplificata utilizzando una Carotene Desaturasi (CrtI) di origine batterica.
Si è utilizzata la trasformazione delle colture di embrioni di riso mediata da Agrobacterium tumefaciens.
L'A. tumefaciens è un batterio che vive nel suolo, capace di trasferire alcuni geni del proprio plasmide, denominato Tumor Inducing o plasmide Ti, alle piante. Quando questi geni si integrano nel genoma della pianta provocano la formazione di un tumore.
La regione di DNA che A. tumefaciens trasferisce alla pianta è denominata T-DNA ed è fiancheggiata da sequenze ripetute invertite (indicate con LB e RB). Qualsiasi sequenza posta tra LB e RB viene inserita nel genoma della pianta ospite.
Sfruttando le capacità di A. tumefacien si è ottenuto un vettore altamente efficiente per la trasformazione delle piante. Sostituendo i geni all'interno del T-DNA con una cassetta d'espressione genica (contenente un promotore vegetale, il gene di interesse e una sequenza per la terminazione trascrizionale), in questo modo si può far esprimere un gene di interesse in un ospite vegetale senza causare la formazione di tumori.
La trasformazione del riso è stata progettata in modo da inserire tutti i geni mancanti con un singolo evento. Sono stati costruiti tre vettori schematicamente rappresentati nella figura sottostante.
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| Figura: I costrutti di DNA usati nella trasformazione singola e nella cotrasformazione. RB: Bordo destro; LB: bordo sinistro; !: terminatore; pt: peptide di trasporto; p: promotore; gt: glutelina; psy: fitoene sintasi; crtI: carotene desaturasi batterica; lcy: licopene β -ciclasi. Le sequenze di DNA che codificano per gli enzimi del pathway dei carotenoidi sono colorati di nero. |
pB19hpc combina le sequenze per il phytoene sintasi di pianta (psy) originarie del narciso con le sequenze codificanti per la phytoene desaturasi batterica (crtI) originate da Erwinia uredovora, i due geni sono rispettivamente sotto il controllo del promotore della glutelina specifica dell’endosperma (Gt1) e il promotore costitutivo CaMV 35S.
La phytoene sintasi contiene una sequenza al 5’ codificante per un peptide di trasporto specifico per i plastidi.
Questo plasmide quindi dovrebbe dirigere la formazione del lycopene nel plastidio dell’endosperma, che è il sito della formazione del GGPP.
In alternativa per completare il pathway di biosintesi del β-carotene è stata effettuata una cotrasformazione usando due vettori, uno pZPsC che trasporta psy e crtI, come in pB19hpc, ma manca della cassetta di espressione per il marker di selezione aphIV, e l’altro pZCycH che fornisce, sotto il controllo del promotore della glutelina, la sequenza codificante per l’enzima del licopene β-cyclasi originario da N. pseudonarcissus.
Come la phytoene sintasi anche il licopene β-cyclasi è legato a un peptide di trasporto che permette l’importazione nei plastidi. La combinazione di entrambi i plasmidi permette di dirigere la formazione del β-carotene nel endosperma di riso.
Nel prossimo post vi racconterò i risultati ottenuti.
