Introduzione
Il riso è il più importante cibo per l’alimentazione umana, infatti,
per oltre due miliardi e mezzo di uomini questo cereale è l'elemento principale
dell'alimentazione e in alcuni paesi asiatici arriva a fornire addirittura i
tre quarti dell' apporto calorico. Il riso è molto studiato come organismo
modello per il sequenziamento genomico poiché è economico, ha un piccolo genoma
(430 Mb divise in 37.000 geni), presenta moltissime interconnessioni
evolutive con genomi di altre specie vegetali e perché sono disponibili
notevoli informazioni sul suo genoma come mappe fisica, collezione di ESTs e
librerie di lievito (YAC).
Le Expressed Sequence Tags (ESTs) sono dei brevi frammenti di DNA trascritti e sequenziati a partire dal cDNA, rappresentano parti di geni espressi e possono essere utilizzate come sonde per identificare quali proteine vengono espresse in una cellula.
L’International Rice Genome
Sequencing Project (RGP) ha portato
a termine la determinazione ed il sequenziamento dell’intero genoma di riso nel
2005 usando la tecnica clone-by-clone.
Questa tecnica era stata precedentemente provata con efficacia per il
sequenziamento del genoma di uomo, Caenorhabditis
elegans e Arabidopsis. Il
mappaggio fisico del genoma di riso è fondamentale per il successivo
sequenziamento, inoltre, completato anche quest’ultimo è possibile determinare
i geni importanti dal punto di vista biologico ed agricolo.
In passato fu ottenuta una mappa fisica utilizzando YAC che ha
permesso di coprire il 63% del genoma di riso. Tuttavia, l’alta frequenza di chimere,
la difficile manipolazione e purificazione hanno reso YAC un vettore non ideale
per questo mappaggio. Per tale motivo è stato preferito BAC. Questo clone può
contenere larghi inserti ed ha un basso numero di copie di cloni. È stata
quindi fatta una libreria BAC della variante di riso Japonica che è stata sottoposta a fingerprinting sfruttando i siti
di restrizione HindIII ed utilizzata
per determinare la mappa fisica.
I vettori chimerici sono sequenze che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo può essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso.
La mappa fisica di riso è stata
organizzata in 65,287 cloni di BAC
sovrapposti, di cui 62,509 sono stati organizzati in 458 contigs, di cui 284 contengono
circa 362.9 Mb e sono stati messi in correlazione con la mappa genetica,
determinando quindi che il 90.6% del
genoma di riso è rappresentato da tali cloni.
Contigs
Per l’ottenimento di una
mappa fisica è necessario partire da una mappa genetica ottenuta
analizzando la disposizione dei marcatori all’interno della progenie.
Successivamente si procede con la digestione del DNA e la creazione di una
libreria BAC (in questo caso). Questi cloni vengono poi sottoposti a
fingerprinting per eliminare quelli ridondanti o chimerici. Infine,
analizzando la posizione dei marcatori utilizzati per la strutturazione
della mappa genetica è possibile trovare una corrispondenza fra il
frammento di DNA contenuto nel clone e la sua effettiva collocazione
all’interno del genoma. I cloni ancorati sono detti contigs e nel loro complesso formano degli scaffolds.
|
Nessun commento:
Posta un commento