Il Golden Rice Parte 3

Nello scorso post abbiamo visto come si sono ottenute delle piante transgeniche di riso utilizzando A. tumefaciens. Ora vedremo quali sono stati i risultati ottenuti.

I semi maturi della prima generazione, delle linee trasformate e del controllo (riso che non ha subito alcun trattamento), sono stati trattati in modo da isolare l’endosperma, nella maggior parte dei casi i semi provenienti dalle piante trasformate mostravano un colore giallo ad indicare la presenza di carotenoidi.

Un grammo di semi da ogni linea è stato ridotto in una polvere finissima ed estratti per completare la decolorazione con acetone. Gli estratti sono stati quantificati fotometricamente e analizzati qualitativamente tramite HPLC.

 L'HPLC è una tecnica analitica che permette separare una miscela nei suoi componenti, ma può essere anche utilizzata a scopo quantitativo.
Come tutti i metodi cromatografici, l'HPLC è basata sulla separazione selettiva delle molecole di interesse tra due fasi differenti, la fase mobile e la fase stazionaria. In questo caso la fase mobile è un solvente o una miscela di solventi che scorre sotto l'azione dell'alta pressione sopra delle particelle legate alla fase stazionaria. Le molecole del campione, mentre viaggiano attraverso la colonna, vengono selettivamente ripartite tra la fase mobile e la fase stazionaria. Quelle che interagiscono maggiormente con la fase stazionaria rimarranno più a lungo all'interno della colonna e saranno eluite per ultime. Come risultato, il campione uscirà dalla colonna in bande separate (chiamate picchi). Un sensore posizionato al termine della colonna permette di identificare i componenti che eluiscono.

Sotto c'è un immagine riassume il funzionamento dell'HPLC.



Schema riassuntivo HPLC



Si è osservato che nei singoli trasformanti pB19hpc si formava β-carotene e in misura minore anche la luteina e la zeaxantina, perciò il pattern di carotenoidi risultante è molto simile a quello presente nelle foglie verdi. Questo suggerisce che il licopene-α, la β-ciclasi nonché l’idrossilasi sono espresse costitutivamente nel endosperma di riso o che l’espressione di questi enzimi è regolata downstream dalla formazione del licopene o da altri prodotti derivati da questo.

I doppi trasformanti pZPsC/pZCycH mostravano diverse varietà di pattern. Alcuni fenotipi erano simili ai singoli trasformanti mentre altri contenevano il β-carotene come unico carotenoide.

 La linea migliore in termini quantitativi si è rivelata essere quella che produceva 1.6 μg/g di β-carotene su peso secco del endosperma di riso.

 

In seguito sono stati svolti altri esperimenti che sono riusciti ad aumentare il contenuto di provitamina A da 1.6 μg/g a 35 μg/g su peso secco di riso. Questa nuova varietà è stata chiamata Golden Rice 2.

 

 

 

Studi successivi hanno valutato la biodisponibilità della provitamina A nel Golden Rice 2 ed è stato calcolato che 50 gr di GR 2 dovrebbero fornire circa il 60% del RDA per un bambino.

 

Per chi fosse interessato ad approfondire l'argomento segnalo il sito: http://www.goldenrice.org e questa serie di articoli:

 

 

Beyer P., Al-Babili S., Ye X., Lucca P., Schaub P., Welsch R., Potrykus I. (2002). Golden rice: introducing the beta-carotene biosynthesis pathway into rice endosperm by genetic engineering to defeat vitamin A deficiency. J. Nutr.132, 506S–510S.

Ye X, Al-Babili S, Kloti A, Zhang J, Lucca P, et al. (2000) Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway. Science 287: 303–305.

Tang G, Qin J, Dolnikowski G, Russell RM, Grusak MA. Golden Rice is an effective source of vitamin A. Am J Clin Nutr 2009;89:1776–83.

 

 

 

Il Golden Rice parte 2

Come si può inserire il pathway per la produzione della vitamina A nel riso?

Innanzitutto si sono effettuati degli studi per vedere quale intermedio era presente nel riso. Si è scoperto che l'endosperma conteneva il primo intermedio del pathway, il geranylgeranyl difosfato (GGPP).

 

 

 

 

Per arrivare alla formazione del β-carotene si possono seguire due strade differenti, la prima via è quella utilizzata dalle piante e prevede l'utilizzo di due enzimi: il Phytoene Desaturasi, il β-Carotene Desaturasi. Alternativamente la trasformazione può essere semplificata utilizzando una Carotene Desaturasi (CrtI) di origine batterica.

Si è utilizzata la trasformazione delle colture di embrioni di riso mediata da Agrobacterium tumefaciens.

L'A. tumefaciens è un batterio che vive nel suolo, capace di trasferire alcuni geni del proprio plasmide, denominato Tumor Inducing o plasmide Ti, alle piante. Quando questi geni si integrano nel genoma della pianta provocano la formazione di un tumore.

La regione di DNA che A. tumefaciens trasferisce alla pianta è denominata T-DNA ed è fiancheggiata da sequenze ripetute invertite (indicate con LB e RB). Qualsiasi sequenza posta tra LB e RB viene inserita nel genoma della pianta ospite.

Sfruttando le capacità di A. tumefacien si è ottenuto un vettore altamente efficiente per la trasformazione delle piante. Sostituendo i geni all'interno del T-DNA con una cassetta d'espressione genica (contenente un promotore vegetale, il gene di interesse e una sequenza per la terminazione trascrizionale), in questo modo si può far esprimere un gene di interesse in un ospite vegetale senza causare la formazione di tumori.

 

La trasformazione del riso è stata progettata in modo da inserire tutti i geni mancanti con un singolo evento. Sono stati costruiti tre vettori schematicamente rappresentati nella figura sottostante.

 

 



Figura: I costrutti di DNA usati nella trasformazione singola e nella cotrasformazione. RB: Bordo destro; LB: bordo sinistro; !: terminatore; pt: peptide di trasporto; p: promotore; gt: glutelina; psy: fitoene sintasi; crtI: carotene desaturasi batterica; lcy: licopene β -ciclasi. Le sequenze di DNA che codificano per gli enzimi del pathway dei carotenoidi sono colorati di nero.



 

 

 

pB19hpc combina le sequenze per il phytoene sintasi di pianta (psy) originarie del narciso con le sequenze codificanti per la phytoene desaturasi batterica (crtI) originate da Erwinia uredovora, i due geni sono rispettivamente sotto il controllo del promotore della glutelina specifica dell’endosperma (Gt1) e il promotore costitutivo CaMV 35S.

La phytoene sintasi contiene una sequenza al 5’ codificante per un peptide di trasporto specifico per i plastidi.

 

Questo plasmide quindi dovrebbe dirigere la formazione del lycopene nel plastidio dell’endosperma, che è il sito della formazione del GGPP.

 

In alternativa per completare il pathway di biosintesi del β-carotene è stata effettuata una cotrasformazione usando due vettori, uno pZPsC che trasporta psy e crtI, come in pB19hpc, ma manca della cassetta di espressione per il marker di selezione aphIV, e l’altro pZCycH che fornisce, sotto il controllo del promotore della glutelina, la sequenza codificante per l’enzima del licopene β-cyclasi originario da N. pseudonarcissus.

 

Come la phytoene sintasi anche il licopene β-cyclasi è legato a un peptide di trasporto che permette l’importazione nei plastidi. La combinazione di entrambi i plasmidi permette di dirigere la formazione del β-carotene nel endosperma di riso.

Nel prossimo post vi racconterò i risultati ottenuti.

 

Il Golden Rice parte 1

La vitamina A è molto importante negli esseri umani, la sua mancanza può portare a seri problemi della vista come la cecità o può ridurre la risposta del sistema immunitario con il risultato di aumentare il numero o la gravità delle infezioni delle vie respiratorie o del sistema gastrointestinale.

La deficienza di vitamina A affligge 250 milioni di bambini nel mondo, ed è la causa della morte di oltre 3 milioni di bambini all’anno.

Per prevenire questo problema viene sintetizzata chimicamente nei paesi sviluppati e poi distribuita periodicamente alle popolazioni bisognose. Questa si è dimostrata essere una buona strategia, ma di difficile mantenimento per via degli alti costi.

Un metodo alternativo, per ridurre la deficienza di vitamina A, potrebbe essere quello di aggiungerla agli alimenti come ad esempio il riso, che è la fonte primaria di cibo di questi paesi.

Il riso viene generalmente consumato con la rimozione dello strato superiore, la parte utilizzata dei chicchi è l’endosperma, che è ricco di granuli d’amido e corpi proteici, ma privo di molti nutrienti essenziali per il mantenimento della salute dell’uomo.

Così il riso, come principale fonte di cibo, contribuisce alla malnutrizione dei cittadini di 26 paesi, incluse aree altamente popolate di Asia, Africa e America Latina.

Ma come si può ottenere un riso ricco in vitamina A?

Questo risultato non può essere ottenuto con le tecniche di genetica classica, per cui si è ricorsi all'ingegneria genetica.
Tramite una trasformazione mediata da agrobactrium si sono inseriti due geni che hanno permesso di completare il pathway della biosintesi del b-carotene. In questo modo si è ottenuto un riso giallo contenente vitamina A.

Nel prossimo post vi spiegherò più nei dettagli come è avvenuta la trasformazione.

Hello world

Questo blog nasce con l'intento di approfondire e spiegare alcuni argomenti legati alle biotecnologie, un mondo con applicazioni nei settori più diversi, ma di cui non si parla ancora molto fuori dall'ambito accademico.

Le biotecnologie sono in rapida espansione e in futuro potrebbero cambiare enormemente il nostro mondo, in Italia purtroppo c'è molta disinformazione e le persone spesso si dichiarano contro certe applicazioni senza realmente conoscere come funzionano e quali sono i rischi/benefici che ne deriverebbero.

Se desiderate saperne di più su questa affascinante scienza, sui suoi possibili sviluppi e sul funzionamento dei meccanismi base della vita continuate a seguire il mio Blog.