Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso parte 2

Costruzione della libreria di BAC, fingerprinting e montaggio dei contigs

Inizialmente sono state costruite due librerie di cloni BAC analizzando su agarosio il DNA ad alto peso molecolare del genoma di riso. Per fare ciò il DNA fu parzialmente digerito nei siti di restrizione HindIII ed EcoRI  e successivamente rilegati. La trasformazione è stata effettuata su E. Coli piastrato su terreno selettivo. La libreria fatta con HindIII consiste in 36,864 cloni ognuno dei quali contenente in media 129kb, mentre quella effettuata con EcoRI consiste in 55,296 cloni con una media di 121kb ciascuno. È stato calcolato che circa il 5% dei cloni di ogni libreria erano contaminati o non contenevano l’inserto, quindi sono stati in seguito eliminati.


 I 65,287 cloni BAC sono stati sottoposti a fingerprinting.


Il fingerprinting è una tecnica che serve per determinare l’impronta digitale di un clone (in questo caso). Tale tecnica si effettua digerendo il DNA dei cloni in determinati  Siti di restrizione specifici, come HindIII e EcoRI, e successivamente fatto correre su gel. Dopo la corsa saranno visibili le bande dei frammenti generati di ogni contigs. Confrontando il bandeggio dei vari contigs è possibile determinare quali di essi possiedono lo stesso frammento, sono chimerici o non contengono l’inserto d’interesse. Tali analisi viene ottimizzata attraverso un approccio in silico, reso possibile grazie all’utilizzo di appositi programmi come il software IMAGE. I cloni individuati attraverso l’analisi del fingerprinting vengono poi scartati.

Il DNA è stato digerito completamente con HindIII e fatto correre su gel di agarosio ad alta risoluzione. Successivamente ogni clone è stato sottoposto a fingerprinting grazie al software IMAGE che ha analizzato la distanza di ogni frammento di restrizione. Mediamente per ogni clone sono stati trovati 28 frammenti di fingerprinting. Grazie al questa tecnica è stato possibile eliminare i cloni chimerici o ridondanti. La libreria di contigs ottenuta rappresenta circa le 453Mb del genoma di riso. Tale sovrastima è dovuta al fatto che i cloni che compongono il contigs contengono sequenze sovrapponibili fra loro. L’analisi di tutti gli scaffolds ancorati alla mappa genetica ha permesso di risalire a quella fisica. In seguito a questo passaggio è stato fatta una correzione manuale, in modo da eliminare eventuali gap o errori nella mappatura.

Il montaggio dei contigs migliora la mappa fisica in due modi. Primo, identifica i punti di continuità fra i contigs riducendo quindi il numero dei gap. Secondo, identifica i potenziali contigs chimerici individuando false sovrapposizioni o individuando dati in conflitto.

Ancoraggio dei cloni BAC alla mappa genetica

Sono stati utilizzati quattro passaggi per correlare la mappa genetica a quella fisica del genoma di riso. Per primo sono state progettate delle probe partendo dai marcatori genetici utilizzati nel Japanese Rice Genome Program per la mappa genetica. Ogni probe di DNA per l’ibridazione su gel è stata costruita a partire da marker localizzati a intervalli di 3-5 cM su ognuno dei 12 cromosomi di riso, in modo da coprire tutto il genoma (vedi tabella 1). In questo modo è stato possibile assegnare la corretta collocazione del clone sul genoma confrontando i marcatori presenti nei cloni e sulla mappa genetica.

Tabella 1: la tabella mostra i primer, i marker e i contigs usati per il mappaggio di ogni cromosoma.

 

I sequence tagged connectors (STCs) sono le estremità sovrapponibili dei diversi conting. Cercando gli STCs è possibile determinare l’ordine dei contigs anche senza conoscerne l’intera sequenza. La RFLP viene utilizzata per quella classe di marcatori basata su tecniche di ibridazione. Infatti, l’RFLP deve la sua origine alla scoperta degli enzimi di restrizione e all’invenzione della Southern Blot. Questa tecnica è basata sulla disponibilità di sequenze di DNA note, che possono essere utilizzate per individuare sequenze omologhe presenti su genomi in corso di studio e che manifestano una variazione a livello del DNA. Tale variazione è definita polimorfismo, che in questo caso è dovuta ad una variazione della lunghezza dei frammenti di DNA digeriti con gli enzimi di restrizione.

 In secondo luogo è stata fatta un ibridazione in silico. Sono state sequenziale entrambi le estremità di ogni clone BAC delle librerie HindIII e EcoRI, generando 110.438 STCs. Tutte le STCs sono state usate nel tentativo di ancorare i contigs basandosi sulle sequenze di omologia attraverso la RFLP. Dal confronto della mappa ottenuta in silico e quella in vivo è stato possibile verificare se il mappaggio era avvenuto in maniera corretta.

 Terzo, per verificare se i contigs ancorati agli estremi del cromosomi fossero esattamente nella posizione corretta, sono state sequenziate le rispettive estremità destra e sinistra. Da quest’ultime sono stati generati dei primer per amplificare le regioni estreme dei cromosomi. L’amplicone ottenuto è stato utilizzato come sonda nelle librerie  HindIII e EcoRI dei cloni BAC per selezionare gli individui che effettivamente contengono le sequenze fiancheggianti dei cromosomi. Per verificare che i cloni ibridati fossero gli stessi dai quali sono stati generati i primer, sono stati confrontanti i fingerprinting.

Quarto, partendo dai dati ottenuti da una precedente bozza di sequenziamento fatta da Monsanto, sono stati associate in silicio le sequenze dei BAC Monsanto e quelle dei cloni CUGI in modo da ottimizzare la mappa fisica eliminando eventuali errori e chiudendo i gap.

 

Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso Parte 1

Introduzione

 

Il riso è il più importante cibo per l’alimentazione umana, infatti, per oltre due miliardi e mezzo di uomini questo cereale è l'elemento principale dell'alimentazione e in alcuni paesi asiatici arriva a fornire addirittura i tre quarti dell' apporto calorico. Il riso è molto studiato come organismo modello per il sequenziamento genomico poiché è economico, ha un piccolo genoma (430 Mb divise in 37.000 geni), presenta moltissime interconnessioni evolutive con genomi di altre specie vegetali e perché sono disponibili notevoli informazioni sul suo genoma come mappe fisica, collezione di ESTs e librerie di lievito (YAC).

 

Le Expressed Sequence Tags (ESTs) sono dei brevi frammenti di DNA trascritti e sequenziati a partire dal cDNA, rappresentano parti di geni espressi e possono essere utilizzate come sonde per identificare quali proteine vengono espresse in una cellula.    

 

 

L’International Rice Genome Sequencing Project (RGP) ha portato a termine la determinazione ed il sequenziamento dell’intero genoma di riso nel 2005 usando la tecnica clone-by-clone. Questa tecnica era stata precedentemente provata con efficacia per il sequenziamento del genoma di uomo, Caenorhabditis elegans e Arabidopsis. Il mappaggio fisico del genoma di riso è fondamentale per il successivo sequenziamento, inoltre, completato anche quest’ultimo è possibile determinare i geni importanti dal punto di vista biologico ed agricolo.

 

In passato fu ottenuta una mappa fisica utilizzando  YAC che ha permesso di coprire il 63% del genoma di riso. Tuttavia, l’alta frequenza di chimere, la difficile manipolazione e purificazione hanno reso YAC un vettore non ideale per questo mappaggio. Per tale motivo è stato preferito BAC. Questo clone può contenere larghi inserti ed ha un basso numero di copie di cloni. È stata quindi fatta una libreria BAC della variante di riso Japonica che è stata sottoposta a fingerprinting sfruttando i siti di restrizione HindIII ed utilizzata per determinare la mappa fisica.

I vettori chimerici sono sequenze che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo può essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso.

 

La mappa fisica di riso è stata organizzata in 65,287 cloni di BAC sovrapposti, di cui 62,509 sono stati organizzati in 458 contigs, di cui 284 contengono circa 362.9 Mb e sono stati messi in correlazione con la mappa genetica, determinando quindi che il 90.6% del genoma di riso è rappresentato da tali cloni.

 

Contigs Per l’ottenimento di una mappa fisica è necessario partire da una mappa genetica ottenuta analizzando la disposizione dei marcatori all’interno della progenie. Successivamente si procede con la digestione del DNA e la creazione di una libreria BAC (in questo caso). Questi cloni vengono poi sottoposti a fingerprinting per eliminare quelli ridondanti o chimerici. Infine, analizzando la posizione dei marcatori utilizzati per la strutturazione della mappa genetica è possibile trovare una corrispondenza fra il frammento di DNA contenuto nel clone e la sua effettiva collocazione all’interno del genoma. I cloni ancorati sono detti contigs e nel loro complesso formano degli scaffolds.

 

 

 

Il Golden Rice Parte 3

Nello scorso post abbiamo visto come si sono ottenute delle piante transgeniche di riso utilizzando A. tumefaciens. Ora vedremo quali sono stati i risultati ottenuti.

I semi maturi della prima generazione, delle linee trasformate e del controllo (riso che non ha subito alcun trattamento), sono stati trattati in modo da isolare l’endosperma, nella maggior parte dei casi i semi provenienti dalle piante trasformate mostravano un colore giallo ad indicare la presenza di carotenoidi.

Un grammo di semi da ogni linea è stato ridotto in una polvere finissima ed estratti per completare la decolorazione con acetone. Gli estratti sono stati quantificati fotometricamente e analizzati qualitativamente tramite HPLC.

 L'HPLC è una tecnica analitica che permette separare una miscela nei suoi componenti, ma può essere anche utilizzata a scopo quantitativo.
Come tutti i metodi cromatografici, l'HPLC è basata sulla separazione selettiva delle molecole di interesse tra due fasi differenti, la fase mobile e la fase stazionaria. In questo caso la fase mobile è un solvente o una miscela di solventi che scorre sotto l'azione dell'alta pressione sopra delle particelle legate alla fase stazionaria. Le molecole del campione, mentre viaggiano attraverso la colonna, vengono selettivamente ripartite tra la fase mobile e la fase stazionaria. Quelle che interagiscono maggiormente con la fase stazionaria rimarranno più a lungo all'interno della colonna e saranno eluite per ultime. Come risultato, il campione uscirà dalla colonna in bande separate (chiamate picchi). Un sensore posizionato al termine della colonna permette di identificare i componenti che eluiscono.

Sotto c'è un immagine riassume il funzionamento dell'HPLC.



Schema riassuntivo HPLC



Si è osservato che nei singoli trasformanti pB19hpc si formava β-carotene e in misura minore anche la luteina e la zeaxantina, perciò il pattern di carotenoidi risultante è molto simile a quello presente nelle foglie verdi. Questo suggerisce che il licopene-α, la β-ciclasi nonché l’idrossilasi sono espresse costitutivamente nel endosperma di riso o che l’espressione di questi enzimi è regolata downstream dalla formazione del licopene o da altri prodotti derivati da questo.

I doppi trasformanti pZPsC/pZCycH mostravano diverse varietà di pattern. Alcuni fenotipi erano simili ai singoli trasformanti mentre altri contenevano il β-carotene come unico carotenoide.

 La linea migliore in termini quantitativi si è rivelata essere quella che produceva 1.6 μg/g di β-carotene su peso secco del endosperma di riso.

 

In seguito sono stati svolti altri esperimenti che sono riusciti ad aumentare il contenuto di provitamina A da 1.6 μg/g a 35 μg/g su peso secco di riso. Questa nuova varietà è stata chiamata Golden Rice 2.

 

 

 

Studi successivi hanno valutato la biodisponibilità della provitamina A nel Golden Rice 2 ed è stato calcolato che 50 gr di GR 2 dovrebbero fornire circa il 60% del RDA per un bambino.

 

Per chi fosse interessato ad approfondire l'argomento segnalo il sito: http://www.goldenrice.org e questa serie di articoli:

 

 

Beyer P., Al-Babili S., Ye X., Lucca P., Schaub P., Welsch R., Potrykus I. (2002). Golden rice: introducing the beta-carotene biosynthesis pathway into rice endosperm by genetic engineering to defeat vitamin A deficiency. J. Nutr.132, 506S–510S.

Ye X, Al-Babili S, Kloti A, Zhang J, Lucca P, et al. (2000) Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway. Science 287: 303–305.

Tang G, Qin J, Dolnikowski G, Russell RM, Grusak MA. Golden Rice is an effective source of vitamin A. Am J Clin Nutr 2009;89:1776–83.

 

 

 

Il Golden Rice parte 2

Come si può inserire il pathway per la produzione della vitamina A nel riso?

Innanzitutto si sono effettuati degli studi per vedere quale intermedio era presente nel riso. Si è scoperto che l'endosperma conteneva il primo intermedio del pathway, il geranylgeranyl difosfato (GGPP).

 

 

 

 

Per arrivare alla formazione del β-carotene si possono seguire due strade differenti, la prima via è quella utilizzata dalle piante e prevede l'utilizzo di due enzimi: il Phytoene Desaturasi, il β-Carotene Desaturasi. Alternativamente la trasformazione può essere semplificata utilizzando una Carotene Desaturasi (CrtI) di origine batterica.

Si è utilizzata la trasformazione delle colture di embrioni di riso mediata da Agrobacterium tumefaciens.

L'A. tumefaciens è un batterio che vive nel suolo, capace di trasferire alcuni geni del proprio plasmide, denominato Tumor Inducing o plasmide Ti, alle piante. Quando questi geni si integrano nel genoma della pianta provocano la formazione di un tumore.

La regione di DNA che A. tumefaciens trasferisce alla pianta è denominata T-DNA ed è fiancheggiata da sequenze ripetute invertite (indicate con LB e RB). Qualsiasi sequenza posta tra LB e RB viene inserita nel genoma della pianta ospite.

Sfruttando le capacità di A. tumefacien si è ottenuto un vettore altamente efficiente per la trasformazione delle piante. Sostituendo i geni all'interno del T-DNA con una cassetta d'espressione genica (contenente un promotore vegetale, il gene di interesse e una sequenza per la terminazione trascrizionale), in questo modo si può far esprimere un gene di interesse in un ospite vegetale senza causare la formazione di tumori.

 

La trasformazione del riso è stata progettata in modo da inserire tutti i geni mancanti con un singolo evento. Sono stati costruiti tre vettori schematicamente rappresentati nella figura sottostante.

 

 



Figura: I costrutti di DNA usati nella trasformazione singola e nella cotrasformazione. RB: Bordo destro; LB: bordo sinistro; !: terminatore; pt: peptide di trasporto; p: promotore; gt: glutelina; psy: fitoene sintasi; crtI: carotene desaturasi batterica; lcy: licopene β -ciclasi. Le sequenze di DNA che codificano per gli enzimi del pathway dei carotenoidi sono colorati di nero.



 

 

 

pB19hpc combina le sequenze per il phytoene sintasi di pianta (psy) originarie del narciso con le sequenze codificanti per la phytoene desaturasi batterica (crtI) originate da Erwinia uredovora, i due geni sono rispettivamente sotto il controllo del promotore della glutelina specifica dell’endosperma (Gt1) e il promotore costitutivo CaMV 35S.

La phytoene sintasi contiene una sequenza al 5’ codificante per un peptide di trasporto specifico per i plastidi.

 

Questo plasmide quindi dovrebbe dirigere la formazione del lycopene nel plastidio dell’endosperma, che è il sito della formazione del GGPP.

 

In alternativa per completare il pathway di biosintesi del β-carotene è stata effettuata una cotrasformazione usando due vettori, uno pZPsC che trasporta psy e crtI, come in pB19hpc, ma manca della cassetta di espressione per il marker di selezione aphIV, e l’altro pZCycH che fornisce, sotto il controllo del promotore della glutelina, la sequenza codificante per l’enzima del licopene β-cyclasi originario da N. pseudonarcissus.

 

Come la phytoene sintasi anche il licopene β-cyclasi è legato a un peptide di trasporto che permette l’importazione nei plastidi. La combinazione di entrambi i plasmidi permette di dirigere la formazione del β-carotene nel endosperma di riso.

Nel prossimo post vi racconterò i risultati ottenuti.

 

Il Golden Rice parte 1

La vitamina A è molto importante negli esseri umani, la sua mancanza può portare a seri problemi della vista come la cecità o può ridurre la risposta del sistema immunitario con il risultato di aumentare il numero o la gravità delle infezioni delle vie respiratorie o del sistema gastrointestinale.

La deficienza di vitamina A affligge 250 milioni di bambini nel mondo, ed è la causa della morte di oltre 3 milioni di bambini all’anno.

Per prevenire questo problema viene sintetizzata chimicamente nei paesi sviluppati e poi distribuita periodicamente alle popolazioni bisognose. Questa si è dimostrata essere una buona strategia, ma di difficile mantenimento per via degli alti costi.

Un metodo alternativo, per ridurre la deficienza di vitamina A, potrebbe essere quello di aggiungerla agli alimenti come ad esempio il riso, che è la fonte primaria di cibo di questi paesi.

Il riso viene generalmente consumato con la rimozione dello strato superiore, la parte utilizzata dei chicchi è l’endosperma, che è ricco di granuli d’amido e corpi proteici, ma privo di molti nutrienti essenziali per il mantenimento della salute dell’uomo.

Così il riso, come principale fonte di cibo, contribuisce alla malnutrizione dei cittadini di 26 paesi, incluse aree altamente popolate di Asia, Africa e America Latina.

Ma come si può ottenere un riso ricco in vitamina A?

Questo risultato non può essere ottenuto con le tecniche di genetica classica, per cui si è ricorsi all'ingegneria genetica.
Tramite una trasformazione mediata da agrobactrium si sono inseriti due geni che hanno permesso di completare il pathway della biosintesi del b-carotene. In questo modo si è ottenuto un riso giallo contenente vitamina A.

Nel prossimo post vi spiegherò più nei dettagli come è avvenuta la trasformazione.

Hello world

Questo blog nasce con l'intento di approfondire e spiegare alcuni argomenti legati alle biotecnologie, un mondo con applicazioni nei settori più diversi, ma di cui non si parla ancora molto fuori dall'ambito accademico.

Le biotecnologie sono in rapida espansione e in futuro potrebbero cambiare enormemente il nostro mondo, in Italia purtroppo c'è molta disinformazione e le persone spesso si dichiarano contro certe applicazioni senza realmente conoscere come funzionano e quali sono i rischi/benefici che ne deriverebbero.

Se desiderate saperne di più su questa affascinante scienza, sui suoi possibili sviluppi e sul funzionamento dei meccanismi base della vita continuate a seguire il mio Blog.