Integrazione della Mappa Fisica e Genomica di Riso Parte 1

Introduzione

 

Il riso è il più importante cibo per l’alimentazione umana, infatti, per oltre due miliardi e mezzo di uomini questo cereale è l'elemento principale dell'alimentazione e in alcuni paesi asiatici arriva a fornire addirittura i tre quarti dell' apporto calorico. Il riso è molto studiato come organismo modello per il sequenziamento genomico poiché è economico, ha un piccolo genoma (430 Mb divise in 37.000 geni), presenta moltissime interconnessioni evolutive con genomi di altre specie vegetali e perché sono disponibili notevoli informazioni sul suo genoma come mappe fisica, collezione di ESTs e librerie di lievito (YAC).

 

Le Expressed Sequence Tags (ESTs) sono dei brevi frammenti di DNA trascritti e sequenziati a partire dal cDNA, rappresentano parti di geni espressi e possono essere utilizzate come sonde per identificare quali proteine vengono espresse in una cellula.    

 

 

L’International Rice Genome Sequencing Project (RGP) ha portato a termine la determinazione ed il sequenziamento dell’intero genoma di riso nel 2005 usando la tecnica clone-by-clone. Questa tecnica era stata precedentemente provata con efficacia per il sequenziamento del genoma di uomo, Caenorhabditis elegans e Arabidopsis. Il mappaggio fisico del genoma di riso è fondamentale per il successivo sequenziamento, inoltre, completato anche quest’ultimo è possibile determinare i geni importanti dal punto di vista biologico ed agricolo.

 

In passato fu ottenuta una mappa fisica utilizzando  YAC che ha permesso di coprire il 63% del genoma di riso. Tuttavia, l’alta frequenza di chimere, la difficile manipolazione e purificazione hanno reso YAC un vettore non ideale per questo mappaggio. Per tale motivo è stato preferito BAC. Questo clone può contenere larghi inserti ed ha un basso numero di copie di cloni. È stata quindi fatta una libreria BAC della variante di riso Japonica che è stata sottoposta a fingerprinting sfruttando i siti di restrizione HindIII ed utilizzata per determinare la mappa fisica.

I vettori chimerici sono sequenze che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo può essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso.

 

La mappa fisica di riso è stata organizzata in 65,287 cloni di BAC sovrapposti, di cui 62,509 sono stati organizzati in 458 contigs, di cui 284 contengono circa 362.9 Mb e sono stati messi in correlazione con la mappa genetica, determinando quindi che il 90.6% del genoma di riso è rappresentato da tali cloni.

 

Contigs Per l’ottenimento di una mappa fisica è necessario partire da una mappa genetica ottenuta analizzando la disposizione dei marcatori all’interno della progenie. Successivamente si procede con la digestione del DNA e la creazione di una libreria BAC (in questo caso). Questi cloni vengono poi sottoposti a fingerprinting per eliminare quelli ridondanti o chimerici. Infine, analizzando la posizione dei marcatori utilizzati per la strutturazione della mappa genetica è possibile trovare una corrispondenza fra il frammento di DNA contenuto nel clone e la sua effettiva collocazione all’interno del genoma. I cloni ancorati sono detti contigs e nel loro complesso formano degli scaffolds.